人淋巴细胞分离液Lymphoprep的使用方法

发布：2012-08-04  更新：2023-07-27

2021年6月1日更新：Lymphoprep今日起归属于德国Serumwerk Bernburg公司，有了新的货号。

2020年12月20日更新：Axis-Shield/Alere Technologies AS/Abbott Diagnostics Technologies AS厂家以前提供的Lymphoprep中文说明书，用户需要可以点击下载。

德国Serumwerk Bernburg（以前归Axis-Shield/Alere Technologies AS/Abbott Diagnostics Technologies AS公司所有）的人淋巴细胞分离液Lymphoprep为较多科研和临床用户所使用，本文依据厂家说明书和用户的使用情况，依次列出了该分离液的使用方法步骤，供参考。

说明：

1、此分离液得到的实际为淋巴细胞和单核细胞的混合物——单个核细胞（Mononuclear Cells/MNC)，因其中单核细胞所占数量和比例较小，所以一般人们习惯称之为淋巴细胞分离液。

2、此分离液即人们习惯称为Ficoll的淋巴细胞分离液，尽管事实上Ficoll只是该分离液中的成份之一。

具体使用步骤：

1、保证Lymphoprep分离液的温度在15度-25度。

2、在含有抗凝剂（EDTA、heparin、或ACD）的管子内收集血液，或者用去纤维蛋白的血液。此处抗凝剂的选择取决于得到淋巴细胞以后，后续实验的要求，一般选取EDTA即可。

3、去掉瓶盖，将瓶子颠倒几次，以保证瓶子内溶液均匀。

4、按下述方法用注射器或移液器吸出Lymphoprep分离液：

    注射器：将瓶子倒过来至合适的角度，注射器针头扎过橡胶瓶盖，吸取所需体积的Lymphoprep分离液。

    移液器：

5、按照下表用等体积的0.9%的NaCl溶液（即生理盐水）或等渗透压的PBS及培养基稀释血液。

血液(mL)
稀释液 (mL)
Lymphoprep(mL)
离心管(mL)
1
1
1.5
5
2
2
3
14
3
3
3
14
4
4
4
14
5
5
10
50
10
10
15
50
15
15
15
50

6、小心地将稀释后的血液铺加到离心管里面的Lymphoprep分离液上面，注意尽量不要将血液和分离液的界面混了。此处铺层可以采用从上面铺，或从下面铺两种方法。铺层的关键是不能让血液和分离液混在一起，要界面分层清晰。

7、在室温下（15 - 25°C，最好20°C），用水平转子离心机，800g的离心力，离心20分钟。（如果血液存放时间超过2小时——从人体抽出算起，离心时间延长为30分钟）。

8、离心前和离心后，离心管内液体分层如下图所示。离心后，离心管内位于血浆和分离液界面处的明显白色的一层即为淋巴细胞层。  

9、用移液管直接吸取淋巴细胞层，注意，不要去除上面的血液层，而是直接吸取。移至另一离心管中。

10、用大约2倍体积的0.9%的NaCl溶液（生理盐水）或PBS稀释收集到的淋巴细胞，在250g-300g的离心力下，离心10分钟，（此处在加上稀释液后的体积在15ml离心管内不宜超过5-6ml，体积过大，会降低淋巴细胞的产率），收集沉淀，即得到所需的人外周血单个核细胞，即可用于后续的实验。

结果：

对于大多数正常人和病人的外周血、脐带血、及骨髓样本，Lymphoprep都能够快速、简单、可靠地得到优异的分离效果。
获得的单个核细胞悬浮液中红细胞的污染通常在总细胞数的 1-5% 之间。
在密集的免疫抑制治疗期间，一些未成熟的中性粒细胞可能会与淋巴细胞在一起。
使用肝素纳抗凝血时，必须去除大部分血小板，以避免细胞毒性试验中的抑制作用。

Lymphoprep和Ficoll-Paque分离效果对比