用Optiprep分离人和其它灵长类血液多叶核白细胞

发布：2021-05-24  更新：2023-03-29

分离人血液多叶核白细胞（Polymorphonuclear Leukocytes/granulocytes，多形核细胞/多型核细胞），一般用即用型产品Polymorphprep（Axis-Shield/Alere Technologies AS，Cat No：1114683），操作简单，效果也比较满意，但对于某些人员的血液（如贫血），和血液样本从人体抽出后超过2小时时，该产品效果欠佳，这时可以考虑本方案。

本方案需要先将血液制备成富含白细胞的血浆（LRP/leukocyte-rich plasma )，再利用多叶核白细胞和单个核细胞的密度差，在离心管中依次铺上配制成的不同密度的分离液，再离心，从而在离心管中不同的界面处，分别得到多叶核白细胞和单个核细胞。该方案更为通用。具体步骤如下：

  1. 溶液准备：

溶液A：OptiPrep™ (60%, w/v iodixanol)，使用前轻轻摇晃均匀；

溶液B：等渗盐溶液，0.85% (w/v) NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.4；

溶液C：6% (w/v) 聚蔗糖(Mr = 400-500x 10^3)，在0.85% (w/v) NaCl溶液中；

溶液D：红细胞裂解液；

溶液E：1.8 (w/v) NaCl, 20 mM Hepes-NaOH, pH 7.4。

  1. 分离步骤

（1）向9体积新鲜的EDTA抗凝血加入1体积的溶液C；(Notes1)

（2）室温放置20-40 min，聚集的红细胞沉淀到底部，然后吸出上清，获得富白细胞血浆(leukocyte-rich plasma, LRP)；

（3）配置密度分离液：1.077g/ml (5体积OptiPrep™ + 17体积溶液B)、1.090 g/ml (8体积OptiPrep™ +22体积溶液B)或1.095 g/ml (17体积OptiPrep™ + 43体积溶液B)；(Notes 2)

（4）依次向离心管中加入2.5-3.0 ml的1.090 g/ml或1.095 g/ml密度分离液、相同体积(2.5-3.0 ml)的1.077 g/ml密度分离液、5 ml的LRP；(见图)

（5）水平转子，18-22℃，800×g离心25 min；

（6）此时出现两个白膜层，下层为多形核粒细胞层(PMNs)，上层为单个核细胞层，用移液器小心吸取目标细胞层；（见图）

（7）使用溶液B稀释获得的PMNs悬液(1:1)，250-350×g离心10min，获得PMNs；

（8）加入使用3 ml溶液D，37℃孵育7min，裂解红细胞（或者直接加入3 ml冰冷的蒸馏水，30s后加入3 ml溶液E，以裂解红细胞）；

（9）250-300×g离心15 min，根据实验需要重悬细胞。

  1. 注意事项（Notes）

① 如果不想让细胞暴露于聚蔗糖溶液(研究表明，聚蔗糖大分子可能会吸附白细胞)，可以直接在18-22℃下，200×g离心15-20min，然后取红细胞上层的血浆上清中的白细胞层，在步骤4中使用；

② 如果使用1.090 g/ml密度，少量中性粒细胞和大量嗜酸性粒细胞会通过该层沉淀；如果使用1.095 g/ml密度，几乎所有的PMNs被沉淀在该层。另外，若LRP中残余少量红细胞，使用低密度可能会污染PMNs层。

该方案已经在多篇文献中用到，如下是其中的一部分：

 

种属

密度梯度和离心参数

参考资料

人

碘克沙醇溶液密度 1.077+1.090g/ml，离心力 1200g离心时间 25 min

3

 

碘克沙醇溶液密度 1.077+1.090g/ml，离心力 800g离心时间 30 min

4

 

碘克沙醇溶液密度 1.077+1.090g/ml，离心力 600g离心时间 20 min

5

 

即用型PBMC分离液+碘克沙醇溶液密度1.095g/ml,离心力400/500g离心时间  25/20min

6-14

猴子

Iodixanolsolutionsof1.077+1.095g/ml

15

该方案也已用在多种其它动物血液上，如牛，豚鼠，小鼠，兔和大.等，具体文献件参考资料2.

用到的产品：

 

名称

规格

品牌

货号

Optiprep分离液

250ml

Axis-Shield/Alere Technologies AS

1114542

红细胞裂解液

100ml

天津灏洋/TBD

NH4CL2009

聚蔗糖400Ficoll 400

100g

BioFroxx

1345GR100

HEPES, free acid

100g

碧云天

ST092-100g

EDTA (≥99%, BioPremium)

250g

碧云天

ST1303-250g

 参考资料：

  1. Isolation of human polymorphonuclear leukocytes (granulocytes) from aleukocyte rich plasma in a discontinuous iodixanol gradient （Axis-Shield/Alere Technologies AS/Serumwerk Bernburg AG厂家的OptiPrep Application Sheet C12）
  2. Mononuclear cells, monocytes and polymorphonuclear leukocytes（Axis-Shield/Alere Technologies AS/Serumwerk Bernburg AG厂家的OptiPrep Reference List RC01）
  3. Yuan, Z-N, Tolo, K., Schenck, K. and Helgeland, K. (1999) Increased levels of soluble Fc receptor III in gingival fluid periodontal lesions Oral Microbiol. Immunol., 14, 172-175
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