发布:2023-07-24 更新:2023-07-25
使用淋巴细胞分离液时需要仔细铺放血样,实验用时相对较久,若血样量较多,实验人员容易疲劳。达优人外周血淋巴细胞分离管已预分装分离液,并且管中固定了一块筛板,血样可直接倒入、无需铺层,能缩短近50%实验用时。以下9个分离管实验技巧,可帮助您在使用分离管快速进行分离的同时,保证PBMC的得率和纯度。
1、抗凝剂的选择
若后续需要进行ELISPOT实验以及细胞培养实验,采血时需要选择肝素抗凝剂,因为EDTA抗凝剂通过螯合钙抑制凝血,螯合钙可能在抗原特异性再刺激过程中损害细胞因子分泌。
2、最佳分离温度
包括分离管在内的分离产品,最佳分离温度为(20±5)℃。温度过高时,以聚蔗糖为主要成分的分离液密度会降低,部分淋巴细胞会进入分离液层;温度过低,以聚蔗糖为主要成分的分离液密度会增加,红细胞在低温时也会减少聚集,所以与室温条件相比,红细胞很难沉到分离液层下方,容易混到PBMC层里。因此分离过程中需要保证血样和分离管都处于室温状态。
3、只有冷藏血怎么办?
若使用冷藏血进行分离,一般PBMC层中红细胞会比较多,并且PBMC活性会受到一定影响。建议分离前将血样恢复室温,且适当延长离心时间,例如延长至30min。需要注意的是,若血样冷藏较久,即使血样已恢复室温并延长离心时间,分离效果也无法与新鲜血样相比。建议血液在室温储存,并且储存时间不超过2小时。
4、血样用量
利用红细胞将原本位于管底的分离液置换到红细胞上方,分离液则将密度相对较小的PBMC和血浆顶到筛板上方,而血液中的红细胞数量是固定的,如果血液的用量太少,则分离后红细胞的置换效果差,PBMC可能会紧贴分离管中的筛板,难以吸出,此时即使稀释血样也无法改善分离效果。也因此红细胞沉降液并不推荐搭配分离管使用,沉降处理后红细胞量变少,置换效果差。
如果血液的用量太多,则可能导致红细胞超过筛板,PBMC层模糊、分离效果下降。综上,15mL分离管的血样推荐用量为3mL~6mL;50mL分离管的血样推荐用量为15mL~25mL。
5、分离产品需要搭配水平转子离心机
使用水平转子离心机,能形成多个水平梯度层,同时保证在离心结束时,管中的液体也能保持各个水平梯度的位置。若离心机的升降速档次共有10档、且第10档为最高档,建议将加速与减速调整到第3档。降速时可以关闭离心机,让离心机自然停止。需要注意的是,如果离心机不可设置升降速档次,PBMC层会比较模糊。
6、使用分离管如何回收血浆
直接倒入血样,离心15min后血样分层清晰,分别吸出血浆和PBMC层即可,需要注意的是,血浆紧贴PBMC,如果把血浆完全吸出,会吸到一部分PBMC,可剩余少量血浆,提升PBMC得率。
7、血浆浑浊或血浆偏红,是什么情况?
有4种可能:1.高脂饮食,建议饭前、空腹抽血,饭后抽血容易导致血浆浑浊;2.亚健康状态;3.药物影响;4.病人血液。
血样出现溶血现象,注意不要撞击、跌落、冻融血样;也有可能是病人血样。
溶血现象产生的细胞碎片、血红素等杂质会悬浮于分离液中,在吸取PBMC时容易混入,而混入PBMC的细胞碎片和血红素很难清洗去除,在进行ELISPOT实验时,有可能沉积在培养板底,严重影响细胞因子和抗体的结合,进而影响实验结果。
8、取出PBMC的方法
使用分离管分离出PBMC后,可以选择直接倒出或吸出PBMC,若需要相对更高的细胞得率,可选择直接倒出筛板上方的液体;若需要相对更高的细胞纯度,可选择巴氏吸管或移液枪吸出PBMC。
9、使用什么方式进行PBMC计数最合适?
对于PBMC计数来说,AO/PI最佳。
AO/PI:可以将有核的活细胞和有核的死细胞分开计数,且红细胞不染色,其中AO可以通过完整的细胞膜,嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核,呈现绿色荧光;PI只能通过不完整的细胞膜,即死细胞的细胞膜,嵌入所有死细胞的细胞核,呈现红色荧光。此时活/死PBMC可呈现荧光信号。而成熟的红细胞及血小板,因为没有细胞核,不能被AO/PI染色,因此可以完全被排除在外不被计数。
乙酸亚甲基蓝:3%乙酸亚甲基蓝可以计数有核细胞,但不能区分死活细胞。其中3%乙酸可以破坏细胞膜;亚甲基蓝可以结合核酸,使细胞核染色。细胞计数过程中所有细胞的细胞膜都会被裂解,但红细胞没有细胞核所以不会被计算在内。虽然3%乙酸亚甲基蓝计数法不能区分死活细胞,但一般来说红细胞会比死细胞多,所以这个计数法也可以使用。
台盼蓝:正常活细胞细胞膜结构完整,台盼蓝不能进入细胞内,活细胞呈透明状;通常细胞膜完整性丧失时,即可认为细胞已经死亡,因此对于死细胞或细胞膜不完整的细胞来说,细胞膜通透性增加,台盼蓝可以进入细胞内,把细胞染成蓝色,所以台盼蓝可以区分活死细胞,但不能区分红细胞和有核细胞。
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