9个分离管实验技巧，助您快速分离高得率、高纯度PBMC

发布：2023-07-24  更新：2023-07-25

使用淋巴细胞分离液时需要仔细铺放血样，实验用时相对较久，若血样量较多，实验人员容易疲劳。达优人外周血淋巴细胞分离管已预分装分离液，并且管中固定了一块筛板，血样可直接倒入、无需铺层，能缩短近50%实验用时。以下9个分离管实验技巧，可帮助您在使用分离管快速进行分离的同时，保证PBMC的得率和纯度。

1、抗凝剂的选择

若后续需要进行ELISPOT实验以及细胞培养实验，采血时需要选择肝素抗凝剂，因为EDTA抗凝剂通过螯合钙抑制凝血，螯合钙可能在抗原特异性再刺激过程中损害细胞因子分泌。

2、最佳分离温度

包括分离管在内的分离产品，最佳分离温度为（20±5）℃。温度过高时，以聚蔗糖为主要成分的分离液密度会降低，部分淋巴细胞会进入分离液层；温度过低，以聚蔗糖为主要成分的分离液密度会增加，红细胞在低温时也会减少聚集，所以与室温条件相比，红细胞很难沉到分离液层下方，容易混到PBMC层里。因此分离过程中需要保证血样和分离管都处于室温状态。

3、只有冷藏血怎么办？

若使用冷藏血进行分离，一般PBMC层中红细胞会比较多，并且PBMC活性会受到一定影响。建议分离前将血样恢复室温，且适当延长离心时间，例如延长至30min。需要注意的是，若血样冷藏较久，即使血样已恢复室温并延长离心时间，分离效果也无法与新鲜血样相比。建议血液在室温储存，并且储存时间不超过2小时。

4、血样用量

利用红细胞将原本位于管底的分离液置换到红细胞上方，分离液则将密度相对较小的PBMC和血浆顶到筛板上方，而血液中的红细胞数量是固定的，如果血液的用量太少，则分离后红细胞的置换效果差，PBMC可能会紧贴分离管中的筛板，难以吸出，此时即使稀释血样也无法改善分离效果。也因此红细胞沉降液并不推荐搭配分离管使用，沉降处理后红细胞量变少，置换效果差。

如果血液的用量太多，则可能导致红细胞超过筛板，PBMC层模糊、分离效果下降。综上，15mL分离管的血样推荐用量为3mL~6mL；50mL分离管的血样推荐用量为15mL~25mL。

图1. 50mL分离管加入不同体积血样的分离效果图

5、分离产品需要搭配水平转子离心机

使用水平转子离心机，能形成多个水平梯度层，同时保证在离心结束时，管中的液体也能保持各个水平梯度的位置。若离心机的升降速档次共有10档、且第10档为最高档，建议将加速与减速调整到第3档。降速时可以关闭离心机，让离心机自然停止。需要注意的是，如果离心机不可设置升降速档次，PBMC层会比较模糊。

图2. 水平转子离心机与角转子离心机对比

6、使用分离管如何回收血浆

直接倒入血样，离心15min后血样分层清晰，分别吸出血浆和PBMC层即可，需要注意的是，血浆紧贴PBMC，如果把血浆完全吸出，会吸到一部分PBMC，可剩余少量血浆，提升PBMC得率。

7、血浆浑浊或血浆偏红，是什么情况？

  1. 血浆浑浊

有4种可能：1.高脂饮食，建议饭前、空腹抽血，饭后抽血容易导致血浆浑浊；2.亚健康状态；3.药物影响；4.病人血液。

图3. 血浆浑浊（抗凝血直接离心后示意图）
  1. 血浆偏红

血样出现溶血现象，注意不要撞击、跌落、冻融血样；也有可能是病人血样。

图4 血浆偏红（抗凝血直接离心后示意图）

溶血现象产生的细胞碎片、血红素等杂质会悬浮于分离液中，在吸取PBMC时容易混入，而混入PBMC的细胞碎片和血红素很难清洗去除，在进行ELISPOT实验时，有可能沉积在培养板底，严重影响细胞因子和抗体的结合，进而影响实验结果。

8、取出PBMC的方法

使用分离管分离出PBMC后，可以选择直接倒出或吸出PBMC，若需要相对更高的细胞得率，可选择直接倒出筛板上方的液体；若需要相对更高的细胞纯度，可选择巴氏吸管或移液枪吸出PBMC。

9、使用什么方式进行PBMC计数最合适？

对于PBMC计数来说，AO/PI最佳。

AO/PI：可以将有核的活细胞和有核的死细胞分开计数，且红细胞不染色，其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。此时活/死PBMC可呈现荧光信号。而成熟的红细胞及血小板，因为没有细胞核，不能被AO/PI染色，因此可以完全被排除在外不被计数。

乙酸亚甲基蓝：3%乙酸亚甲基蓝可以计数有核细胞，但不能区分死活细胞。其中3%乙酸可以破坏细胞膜；亚甲基蓝可以结合核酸，使细胞核染色。细胞计数过程中所有细胞的细胞膜都会被裂解，但红细胞没有细胞核所以不会被计算在内。虽然3%乙酸亚甲基蓝计数法不能区分死活细胞，但一般来说红细胞会比死细胞多，所以这个计数法也可以使用。

台盼蓝：正常活细胞细胞膜结构完整，台盼蓝不能进入细胞内，活细胞呈透明状；通常细胞膜完整性丧失时，即可认为细胞已经死亡，因此对于死细胞或细胞膜不完整的细胞来说，细胞膜通透性增加，台盼蓝可以进入细胞内，把细胞染成蓝色，所以台盼蓝可以区分活死细胞，但不能区分红细胞和有核细胞。

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