【产品简介】

脐带血收集采用自然放血且从产房采集到细胞分离时长一般大于2小时，与外周血静脉 采血且及时分离相比会影响分离效果，为此，灏洋优化配方以提高脐带血干细胞分离得率，请 广大医疗及科研用户使用并提出宝贵意见。

【包装规格】

【实验前准备】

1.   适用仪器

最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。

（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）

2.   抗凝剂的选择 在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验 为此，天津灏洋特别开发出专用实验动物抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。

3.   PBMC 高效离心管（详见 PBMC 高效离心管使用说明）

4.   参考值（目的细胞参考范围）

本试剂可保证目的细胞的提取率大于80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞，请 配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 23℃。）的条件下进行。

方法一：

1. 新鲜抗凝脐血与生理盐水及红细胞沉降液（6%羟乙基淀粉）按 1 ：1 ：1  的比例混合，自然 沉降  30min（具体沉降时间应根据不同样本对应调整以保证沉降效果）。

2. 沉降后取上层液体，以 300g 离心 15min，弃去50%上清，以剩余50%上清重悬沉淀，制成 细胞悬液。

3. 取 50mL 的 PBMC 高效离心管，加入 17ml 的分离液，以 200g 离心 1min，将分离液全部离 心至隔片以下，倾去隔片上残留的分离液。

4. 将细胞悬液加至隔片上，400-500g，离心20-30min。

5. 离心后取白色环状目的细胞层，清洗后重悬备用。 注：此方法会损失 30%的目的细胞。

方法二：（推荐方法）

1. 新鲜抗凝脐血与红细胞沉降液（6%羟乙基淀粉）按 2 ：1  的比例混合。

2. 取 50mL 的 PBMC 高效离心管，加入 15ml 分离液，以 200g 离心 1min，将分离液全部离心 至隔片以下，倾去隔片上残留的分离液。

3. 将与沉降液混匀的样本加至隔片上，以 400-500g，离心25min。

4. 离心后取白色环状目的细胞层，清洗后重悬备用。

【注意事项】

1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取血 2h 内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。血液放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。

3. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系天津灏洋技术支持以寻求帮助，具体联系方式 详见下方生产企业信息。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期  2  年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】 本实验单个核细胞提取率大于 80%。

下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。

【可能存在的问题及解决方法】

1.   由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.  离心力公式及单位换算

3.   本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地

区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离 心时间，对离心转速进行调整。

4.   本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以  50-100g 为基数，直至达到最佳分离效果， 离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。