猫  脾脏  淋巴细胞  

熊猫脾脏组织淋巴细胞分离液KIT

品牌：天津灏洋/TBD点击下载说明书

储存：常温保存，有效期2年。启封后置常温保存

【产品规格】

200ml/Kit

【产品组成】

为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】
1.   适用仪器
最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。
（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）
2.   实验最佳分离时间
为获得最佳的实验结果，最好在取样  2h    内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效 果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
3.   分离液的使用环境
a. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；
b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。
4.   无菌离心管

5.    参考值（目的细胞参考范围）
本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于    80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。
【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 25℃。）的条件下进行。
【脾脏组织单细胞悬液的制备】
1. 取组织块称重后，用眼科剪刀无菌操作，将脾脏组织剪成小块。
2. 将组织块放在 70µm 细胞筛网(产品编号：TBDTM-SC，需要另购)上，用研磨器反复揉 搓，边揉搓边加入匀浆冲洗液 (以 0.1g 组织为例，约加 5-8ml)，使细胞全部通过筛网冲 到离心管中。
注：需要让细胞形成单个的细胞悬液冲到离心管中，而不是被研磨挤压到离心管中。 目的：使脾脏组织形成单个的细胞，而不是成团或碎片组织。单个的细胞更易分离。

3. 弃去筛网，组织研磨液经 300-400g，离心 10min，弃去上清。
4. 用组织样本稀释液重悬组织细胞，将细胞悬液细胞浓度调整为 2×10⁸--1×10⁹/ml (以0.1g 脾脏组织为例，约使用 0.5-1ml 组织样本稀释液重悬细胞)，备用。
注：A. 多个动物脾脏组织需要分离时，应逐个单独进行，不可同时混合进行研磨。
B. 用组织样本稀释液重悬脾脏组织细胞时，以小鼠或大鼠为例，约使用 0.5ml 或 1.0ml组织样本稀释液重悬细胞。细胞悬液的细胞浓度约为   2×10⁸--1×10⁹/ml。

C. 若发现匀浆冲洗液冲洗的细胞粘度较大，可进行以下处理：
①配置新冲洗液：4 份的匀浆冲洗液加 1 份的胰蛋白酶/EDTA 消化液（产品编号：TE2004Y    需另购）进行稀释，配置为新冲洗液。
②离心管预处理：再研磨开始之前，在离心管中加入  0.5-1ml    胎牛血清，进行保护 和终止胰蛋白酶/EDTA 消化液。
③再进行 2,3,4 实验步骤即可。

各种规格离心管的使用方法（推荐最佳方法）
取一支无菌离心管，加入分离液，后缓慢加入（人＆动物）脾脏组织单细胞悬液。 细胞悬液小心加于分离液液界面之上。（分离液的量不得少于 3ml，细胞悬液在 0.2-2ml 之间）
注：细胞悬液量较多时，需小量分离。细胞悬液量较多，会稀释分离液，影响分离效果。

1. 使用 10ml 无菌硅化离心管：
A. 10ml 无菌硅化离心管最佳比例：4ml 分离液+ 0.5-2.0ml 细胞悬液； B. 最佳离心条件：20℃环境下，400g 离心 30min。
注：离心后，稀释液层由上至下，下 1/3 处稀释液可能包含部分 PBMC 及少量分离液成分；
 

2. 使用 15ml 离心管（或 15ml 高效离心管）：
A. 15ml 普通离心管最佳比例：5ml 分离液+ 5ml 细胞悬液；

B. 15ml 高效离心管最佳比例：4ml 分离液+ 5ml 细胞悬液；

C. 最佳离心条件：20℃环境下，600g 离心 25min。
注：离心后，稀释液层由上至下，下 1/3 处稀释液可能包含部分 PBMC 及少量分离液成分；
 

实验后续方案
1. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色（人＆ 动物）淋巴细胞层（含有少量红细胞）。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
2. ①小心吸取稀释液层转移到新离心管 A 中。
②小心吸取离心管中的环状乳白色（人＆动物）淋巴细胞层转移到新离心管 B 中。
3. 向含有（人＆动物）淋巴细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 洗涤液（产品编号：TBDTM-W）（0.1g 脾脏组织约加 5ml 洗涤液），混匀细胞。

4. 400g，离心 10min。弃去上清。
5. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
6. 250g，离心 10min，弃去上清。
重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml  清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实验要 求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图例

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】

情况一：淋巴细胞层混杂红细胞
1. 吸取有红细胞混杂的淋巴细胞层。
2. 取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的淋巴细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍红 细胞裂解液。
a. 如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液（产品编号：NH4CL2009 需另购）将红细胞 裂解（具体方法见“红细胞裂解液使用说明”）即得目的细胞。
b. 参考红细胞裂解液说明书操作。少时多次裂解后获得淋巴细胞。

【注意事项】
1. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。
2. 吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。
3. 吸取过多的淋巴细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。
4. 分离液用量大于脾脏组织单细胞悬液样本量时，分离效果更佳。
5. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系天津灏洋技术支持以寻求帮助，具体联系方式 详见下方生产企业信息。
【储存条件及有效期】
常温保存，有效期  2    年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如   4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】
本实验淋巴细胞提取率大于 80%。
【可能存在的问题及解决方法】
1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.离心力公式及单位换算
3.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
4.本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50 - 100g  为基数，直至达到最佳分离效果，离心力最小不得小于400g，最大不得大于1200g。离心时间以20 - 30min为准。

备注：TBD0019SOP，2022.1129-3