【包装规格】

2×200ml/Kit

【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】

1.   适用仪器

最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。

（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）

2.   实验最佳分离时间

为获得最佳的实验结果，最好在取样  2h    内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效 果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

3.   分离液的使用环境

a. 分离液需常温（15℃-25℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 20℃-25℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。

4.   无菌离心管

5.  参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于 80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 25℃。）的条件下进行。

【脾脏组织单细胞悬液的制备】

1. 取组织块称重后，用眼科剪刀无菌操作，将脾脏组织剪成小块。

2. 将组织块放在 70µm 细胞筛网(品牌：Falcon，货号：352350，需要另购)上，用研磨器反复揉 搓，边揉搓边加入匀浆冲洗液 (以 0.1g 组织为例，约加 5-8ml)，使细胞全部通过筛网 冲到离心管中。

注：需要让细胞形成单个的细胞悬液冲到离心管中，而不是被揉搓研磨挤压到离心管中。 目的：使脾脏组织形成单个的细胞，而不是成团或碎片组织。单个的细胞更易分离。

3. 弃去筛网，组织研磨液经 300-400g，离心 10min，弃去上清。

4. 用组织样本稀释液重悬组织细胞，将细胞悬液细胞浓度调整为 2×10⁸--1×10⁹/ml (以0.1g 组织为例，约使用 0.5-1ml 组织样本稀释液重悬细胞)，备用。

注：A. 多个动物脾脏组织需要分离时，应逐个单独进行，不可同时混合进行揉搓研磨。

B. 用组织样本稀释液重悬组织细胞时，以小鼠或大鼠为例，约使用 0.5ml 或 1.0ml 组 织样本稀释液重悬细胞。细胞悬液的细胞浓度约为 2×10⁸--1×10⁹/ml。

C. 若发现匀浆冲洗液冲洗的细胞粘度较大，可进行以下处理：

①配置新冲洗液：4 份的匀浆冲洗液加 1 份的胰蛋白酶/EDTA 消化液（产品编号：TE2004Y 需另购）进行稀释，配置为新冲洗液。

②离心管预处理：再研磨开始之前，在离心管中加入  0.5-1ml 胎牛血清，进行保护 和终止胰蛋白酶/EDTA 消化液。

③再进行 2,3,4 实验步骤即可。

根据脾脏组织样本单细胞悬液的量，分以下两种情况：

情况 A：样本细胞悬液量 0.5-1.5ml 时，实验方法如下：

1.  取一支 10ml 无菌硅化离心管，先加入 3ml 分离液 1，后缓慢加入 1.5ml 分离液 2，形成梯度界面，再缓慢吸取 0.5-1.5ml 样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定 要清晰。（分离液试剂总量不得少于 4ml，样本细胞悬液不得多于 1.5ml。总液体量不 得超过 2/3）。

2.  以 450g ，离心 30min。

3. 离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白 色 NK 细胞层 (第一层白环及上层 50%分离液 2)。第三层为环状乳白色单个核细胞层(下 层 50%分离液 2 及第二层白环)。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞层。第 六层为红细胞和组织细胞碎片层。

4.  ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色 NK 细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 C 中。

5.  向含有 NK 细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 洗涤液（产品编号：TBDTM-W），混匀细 胞。

6.  400g，离心 10min。弃去上清。

7.  用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.  250g，离心 10min，弃去上清。

9.  重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

1.   取一支 15ml 无菌离心管，先加入 5ml 分离液 1，后缓慢加入 2ml 分离液 2，形成梯度 界面，再缓慢吸取  2-3ml 样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（总液体量不得超过 2/3）。

2.   以 600g ，离心 30min。

3. 离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白 色 NK 细胞层 (第一层白环及上层 50%分离液 2)。第三层为环状乳白色单个核细胞层(下 层 50%分离液 2 及第二层白环)。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞层。第 六层为红细胞和组织细胞碎片层。

4.   ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色 NK 细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 C 中。

5.   向含有 NK 细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 洗涤液（产品编号：TBDTM-W），混匀 细胞。

6.   400g，离心 10min。弃去上清。

7.   用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.   250g，离心 10min，弃去上清。

9.   重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

情况一：NK 细胞层和单个核细胞层混在一起不能分开

1.   吸取全部白色环状细胞层，清洗后用组织样本稀释液 1-2ml 重悬细胞。

2.   使用分离液 2 重新提取 NK 细胞。

3.   取 15ml 离心管，加入 4ml 分离液 2，将用组织样本稀释液重悬的 1-2ml 细胞缓慢加于 分离液之液面上，400g，离心  20min。

4.   离心后，离心管可分为 4 层，第一层组织稀释液层，第二层 NK 细胞层，第三层分离液 层，第四层单个核细胞层。

5.   可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得 NK 细胞。

【注意事项】

1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果， 最好在取样 2h 内进行实验，样本存放时间越长，细胞分离效果越差。样本放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。