人  中性粒细胞  外周血  

人外周血中性粒细胞分离液试剂盒

品牌：天津灏洋/TBD

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储存：常温保存，有效期2年。启封后置常温保存

【产品规格】

200ml/Kit

【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】

1.   适用仪器

最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）

2.抗凝剂的选择 在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验（或必须使用枸橼酸钠的医用真空抗凝采 血管）。为此，天津灏洋特别开发出专利抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管 获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。

3.      无菌硅化离心管

4.      目的细胞最佳分离时间

血液离体后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务必于 4 小时内进行分血步骤，超过 4 小时很难顺利进行分离。

5.      分离液的使用环境

a. 分离液需常温（15℃-25℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。

6.参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于   80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 23℃。）的条件下进行。

根据样本量大小，分以下两种情况：

情况 A：血液样本量小于 5ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 15ml 无菌离心管，加入 5ml 分离液 1，再缓慢加入 5ml 血液样本。或取一支 10ml 无菌硅化离心管，加入 4ml 分离液 1，再缓慢加入 3ml 血液样本（分离液不得少于 3ml， 血液样本不得少于 0.5ml）。

2. 以 600g ，离心 30min（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力及离心 时间。）

3. 离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为单个核细胞层，下层细胞 为中性粒细胞层。

4. ①小心吸取血浆层转移到新离心管 A 中备用（分离效果不理想，可进行后续处理方案）

②小心吸取离心管中的单个核细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的中性粒细胞层转移到新离心管 C 中。

5. 向含有中性粒细胞离心管 C 中，加入 10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。

6. 250g，离心 10min。弃去上清。

7. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8. 250g，离心 10min，弃去上清。

9. 重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图例

情况 B：血液样本量大于等于 5ml 时，实验方法如下：

1.      取 50ml 的无菌离心管，小心加入 20ml 分离液 1，加入血液样本量 5~15ml（总液体量不 得超过 2/3）。

2.      以  600g，离心  30min。（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大， 离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。）

3.      离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为单个核细胞层，下层细胞为中性粒细胞层。

4.      ①小心吸取血浆层转移到新离心管  A    中备用（分离效果不理想，可进行后续处理方案）。

②小心吸取离心管中的单个核细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的中性粒细胞层转移到新离心管 C 中。

5.      向含有中性粒细胞离心管 C 中，加入 10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。

6.      250g，离心 10min。弃去上清。

7.      用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.      250g，离心 10min，弃去上清。

9.      重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】

情况一：可见单个核细胞层和中性粒细胞层两层细胞（如果中性粒细胞纯度<70%提纯方法 如此步骤）

1. 取中性粒细胞层，清洗后用备用的血浆 3-5ml 重悬细胞。

2. 使用单个核细胞分离液（产品编号：LDS1075 需另购）提纯。

a.   取 15ml 离心管，加入 5ml 单个核细胞分离液，将用血浆重悬的 3-5ml 中性粒细胞层细胞缓慢加于分离液之液面上，400g，离心  20min。

b.   离心后，离心管底部细胞即为高纯度中性粒细胞，纯度可达   90%以上。

c.   可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得高纯度中性粒细胞。

情况二：单个核细胞层和中性粒细胞层混在一起不能分开

1.   吸取全部白色环状细胞层，清洗后用备用的血浆 3-5ml 重悬细胞。

2.   使用单个核细胞分离液（产品编号：LDS1075   需另购）重新提取中性粒细胞。

a.   取 15ml 离心管，加入 5ml 单个核细胞分离液，将用血浆重悬的 3-5ml 细胞缓慢加于分 离液之液面上，400g，离心 20min。

b.   离心后，离心管底部细胞即为中性粒细胞。

c.   可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得中性粒细胞。

情况三(1)：中性粒细胞层混杂红细胞

1.   吸取有红细胞混杂的中性粒细胞层。

2.   取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的中性粒细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍红细胞裂解液。

a.   如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液（产品编号：NH4CL2009）将红细胞裂解（具 体方法见“红细胞裂解液使用说明”）即得目的细胞。

参考红细胞裂解液说明书（附后）操作。少时多次裂解后获得中性粒细胞。

情况三(2)单个核细胞、中性粒细胞、红细胞，三种细胞完全混杂

1. 吸取混杂层，清洗后用备用的血浆 3-5ml 重悬细胞。

2. 使用单个核细胞分离液（产品编号：LDS1075 需另购）重新提取红细胞与中性粒细胞混 杂层。

a. 取 15ml 离心管，加入 5ml 单个核细胞分离液，将用血浆重悬的 3-5ml 中性粒细胞与红 细胞混杂层缓慢加于分离液之液面上，400g，离心  20min。

b. 离心后，离心管底部细胞即为中性粒细胞与红细胞混杂层。

3. 取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的中性粒细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍 红细胞裂解液。

参考红细胞裂解液说明书（附后）操作，少时多次裂解后获得中性粒细胞。

【注意事项】

1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（夏季 20℃，冬季 22-25℃）的条件下进 行。为获得最佳的实验结果，最好在取血  2h    内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离 效果越差。血液放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。

3. 分离液用量大于血液样本时，分离效果更佳。

4. 血液样本不需稀释，直接进行分离即可。

5. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系天津灏洋技术支持以寻求帮助，具体联系方式 详见下方生产企业信息。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期  2    年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如   4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】 本实验中性粒细胞提取率大于 80%。

下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。

【可能存在的问题及解决方法】

1.       由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.       离心力换算公式

3.      本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离 心时间，对离心转速进行调整。

4.      本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以  50-100g    为基数，直至达到最佳分离效果， 离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。

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备注：2022.1125-2